Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS)

Liquid Chromatograpy – Mass Spectroscopy adalah dua  alat yang digabungkan menjadi satu, yang berfungsi untuk memisahkan beberapa senyawa atau campuran senyawa berdasarkan kepolarannya (prinsip kerja kromatografi), dimana setelah campuran senyawa tersebut terpisah, maka senyawa yang murni akan diidentifikasi berat molekulnya. Data yang didapatkan adalah berat molekul ditambah beberapa muatan dan berat molekul pelarut.

Adapun cara kerja liquid chromatograpy adalah sama dengan HPLC atau liquid chromatograpy lain, adalah :

a.       Analit bersama dengan eluen dari syringe pump atau LC masuk ke dalam cappilary. Di dalam cappilary terdapat anoda (kutup negatif) pada taylor cone dan katoda (kutup negatif) di dekat masukan analit dan eluen. Kutup ini berfungsi agar muatan yang berkumpul pada taylor cone adalah muatan positif sehingga nantinya saat terjadi penyemprotan dan terbentuk droplet (tetes – tetes) tidak bergabung – gabung menjadi droplet yang lebih besar lagi.

b.      Analit dan solven(eluen) disemprotkan melalui taylor cone.

      Akan terbentuk droplet – droplet dimana droplet – droplet itu akan mengalami tahap evaporasi solven untuk mengurangi solven yang menempel di analit. Karena suatu saat, apabila terjadi evaporasi secara terus menerus maka solven yang meliputi analit terkungkung dalam muatan positif yang berlebih, dalam bahasa Inggris tahap seperti ini disebut the ‘rayleigh’  limit is reached, maka akan terjadi explosion yang disebut coulombic explosion dimana akan terjadi pemecahan droplet (tetesan) tadi. Ada beberapa kemungkinan yang terjadi pada droplet – droplet tersebut, yaitu :

1)         analit akan tertambahi satu muatan positif

2)         analit akan tertambahi beberapa muatan positif

3)         analit akan tertambahi satu muatan positif dan satu molekul solven

4)         analit akan tertambahi satu muatan positif dan beberapa molekul solven

5)         analit akant tertambahi beberapa muatan positif dan beberapa molekul solven.

c.       Droplet yang mengalami coulombic exsploison tersebut akan masuk ke dalam cone dimana di sisi kiri dan kanannya sudah mengalir gas Nitrogen (N₂). Gas ini berfungsi agar analit yang terjadi tadi stabil dalam bentuknya dan tidak terganggu oleh pengaruh gas oksigen. Droplet masuk ke dalam cappilary transfer lalu akan dianalisis melalui mass spectrometer.

Muatan positif pada solven berasal dari ion-ion Na⁺, Li⁺, K⁺, NH₄⁺, dan kation lain. Oleh karena pada daerah taylorcone dalam capillary nedle bermuatan negatif,maka analit dalam solven yang memiliki muatan positif akan berkumpul didaerah taylorcone.  Akibatnya pada saat penyemprotan tetesan-tetesan (droplet) permukaanya memiliki muatan positif, dan masing-masing tetesan (droplet) tidak saling menempel lagi (membentuk tetesan yang lebih besar). Pada spektra sering terjadi penambahan berat molekul ion-ion tersebut disamping penambahan berat molekul atau biasanya ditulis dengan [M + molekul ion-ion]. Kemungkinan ion molekul yang terdeteksi di mass spectroscopy adalah [M + H⁺], [M - H⁺], serta analit dengan tambahan seperti Na⁺, K⁺, H₃O⁺, NH₄⁺, dan molekul dari fase gerak ( LC-MS book, Audrey, 2003).

Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti (NMR)

  Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti (NMR)

Nuclear magnetic resonance (NMR) merupakan alat yang digunakan pada penentuan struktur molekul organik. Spektroskopi ¹H-NMR memberikan informasi mengenai lingkungan kimia atom hidrogen, jumlah atom hidrogen dalam setiap lingkungan dan struktur gugusan yang berdekatan dengan setiap atom hidrogen (Creswell, Olaf and Malcon, 1982: 100).

Spektroskopi ¹H-NMR didapatkan pada penyerapan gelombang radio oleh inti-inti tertentu dalam molekul organik, apabila molekul ini berada dalam medan magnet yang kuat (Ralph J.Fessenden, 1983 : 50). Inti yang digunakan akan mempunyai gerakan yang sama seperti yang diberikan oleh pengaruh medan magnet yang digunakan. Bila medan magnet diberikan, inti akan mulai presisi sekitar sumbu putarnya sendiri dengan frekuensi angular (Hardjono, 1991:109).

Jika bidang magnet luar yang kuat itu tidak ada spin inti dari inti magnetik diarahkan secara random. Jika inti diletakan diantara ujung magnet yang kuat, maka mereka mengadopsi orientasi spesifik. Perputaran inti proton ¹H dan ¹³C, dapat mengarah sehingga bidang magnet kecilnya sendiri dapat paralel atau anti paralel terhadap medan magnet luar. Dua orientasi yang mungkin ini tidak  mempunyai energi yang sama sehingga tidak berada dalam jumlah yang sama. Energi orientasi paralel sedikit lebih rendah dan tingkat spin ini sedikit lebih disukai dibandingkan spin anti paralel. Ketika inti yang terarah kemudian diradiasi dengan frekuensi gelombang radio yang cocok dan akan terjadi absorbsi energi maka spin dengan tingkat energi yang lebih rendah berputar membalik ketingkat energi yang lebih tinggi. Jika spin yang berputar membalik ini terjadi, inti dikatakan mengalami resonansi dengan radiasi yang digunakan, oleh karena itulah namanya menjadi Nuclear magnetic resonance (NMR).

Adapun cara menentukan posisi absorbsi, grafik NMR dikalibrasi dan digunakan titik referensi didalam praktik sejumlah kecil TMS ((CH₃)₄Si, Tetrametilsilan) ditambahkan didalam sampel sehingga dihasilkan garis absorbsi referensi standar internal ketika spektrum itu sedang berjalan, TMS digunakan sebagai referensi baik untuk spektra ¹H maupun untuk spektra ¹³C karena pada umumnya untuk semua absorbsi normal senyawa organik menghasilkan puncak tunggal di upfield. Tempat yang pasti pada grafik dimana inti mengabsorbsi disebut pergeseran kimia (chemical shift), menurut konvensi pergeseran kimia TMS dinyatakan sebagai titik nol dan semua absorbsi yang lain normalnya terjadi kearah downfield.  Jumlah sinyal dalam spektrum ¹H-NMR menerangkan berapa banyak proton ekuivalen yang terkandung dalam suatu molekul, sedangkan kedudukan sinyal akan membantu menerangkan jenis-jenis proton dalam suatu molekul, apakah aromatik, alifatik, primer, sekunder, tersier, benzylvinil, asetilen, berdekatan dengan halogen/gugus lain.

Kelimpahan ¹³C di alam sangat kecil kira-kira 1,1%, dibandingkan dengan ¹H(99,98%), karena itu perkembangan ¹³C-NMR lebih lambat dibandingkan dengan ¹H-NMR, disamping itu magnetogryk proton (γ_H) lebih besar dibandingkan dengan magnetogryk karbon (γ_C), kira-kira γ_1H = 4x γ¹³C. Hal ini membuat ¹H-NMR jauh lebih sensitif dibandingkan dengan ¹³C-NMR, tetapi senyawa yang mengandung atom karbon dapat diukur oleh ¹³C-NMR, dan data spektrumnya sangat membantu data ¹H-NMR dalam menentukan struktur senyawa kimia.

Pergeseran kimia ¹³C-NMR rentangannya jauh lebih besar, dari 0-230 ppm, dibandingkan dengan ¹H-NMR yang rentangannya antara 0-10 ppm, kadang-kadang sampai 13-14 ppm (bila ada ikatan hidrogen). Untuk gugus metil (CH₃-) bentuk splitting sesuai dengan rumus (2 n + 1) dan arena n jumlahnya 3 (n = jumlah H yang mengikat C) maka dihasilkan kuartet, untuk metilen (-CH₂-) dihasilkan triplet (n= 2), metin (-CH-) bentuknya doublet (n= 1), sedangkan kuartener (-C-) singlet (n= 0).

Senyawa Xanton

                 Xanton merupakan senyawa organik yang termasuk dalam golongan C₆-C₁-C₆. Xanton merupakan senyawa turunan dari benzofenon yang ditemukan dalam beberapa tumbuhan. Pola hidroksilasinya menunjukkan kaitan biogenesis dengan senyawa golongan flavonoid. Xanton adalah pigmen fenol kuning yang reaksi warnanya serta gerakan kromatografinya serupa dengan flavonoid, namun secara kimia xanton berbeda dengan flavonoid. Xanton dibedakan dengan flavonoid berdasarkan sifat spektrumnya yang khas (Harborne, 1987: 96).

                             Xanton mempunyai serapan di daerah ultraviolet pada panjang gelombang maksimal 230-245 nm, 250-265 nm, 305-330 nm (Harborne, 1987:99). Sedangkan flavonoid mempunyai serapan di daerah ultraviolet pada panjang gelombang 320-380 nm dan 240-270 nm (Syamsul, 1986: 17). Senyawa xanton mempunyai struktur dasar dan sistem penomoran seperti terlihat pada Gambar berikut ini.